Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Perbedaan utama dari dinding sel bakteri gram positif dengan dinding bakteri gram negatif dapat dilihat pada tabel dibawah:

pada bakteri gram positif dinding sel tersusun atas lapisan peptidoglikan yang relatif tebal, dikelilingi lapisan teichoic acid dan pada beberapa species mempunyai lapisan polisakarida, sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan relatip tipis, dikelilingi lapisan lipoprotein, lipopolisakarida, fosfolipid dan beberapa protein.

Peptidoglikan (murein) yaitu susunan yang terdiri dari polimer besar dan terbuat dari N–asetil glukosamin dan asam N–asetil muramat yang saling berikatan silang (cross linking) dengan ikatan kovalen.

Berikut gambar struktur dinding sel bakteri gram positif dengan dinding sel bakteri gram negatif:

Komposisi dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif

Perbandingan Struktur Dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif

dinding sel bakteri gram positif dengan teichoic acid

Cara Kerja Pewarnaan Gram

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan bakteri miring atau tegak dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A  (crystal violet) selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B (iodin) selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram C (aceton) selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D (safranin) selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri.

Tahapan Pewarnaan Gram

Skematis terbentuknya warna pada pewarnaan gram

Proses pewarnaan bakteri, dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi atau mengintensifkan/memperkuat cat primer yang diserap  dinding bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh dinding bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah...

Pembahasan
Penggolongan atas bakteri Gram positif dan Gram negatif dilakukan setelah pencucian dengan alkohol. Bakteri bersifat gram negatif saat dicuci dengan alkohol, lipid akan terektraksi dari dinding sel, pori-porinya mengembang. Zat warna yang mula-mula diberikan keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna.
Telah di ketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan dinding sel gram negatif. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori - pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada langkah pemucatan. Sel bakteri gram positif mengikat zat warna dasar dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat di warnai lagi oleh zat lawan.
Untuk sel-sel gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh pemucat yang di gunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori- pori dinding sel sehingga proses pemucatan pada sel-sel gram negatif berlangsung lebih cepat. Bakteri gram negatif daya pengikatan warna dasarnya tidak kuat sehingga dapat di lunturkan dan dapat di warnai kembali oleh zat lawan.

Gram-positive Bacillus anthracis bacteria (purple rods) in cerebrospinal fluid sample.
The other cells are white blood cells

bakteri gram negatif. Salmonella thypi